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Reproduktionstoxikologie

Ziel des Projektes

Ziel des Projektes ist es, die Allgemeingültigkeit der differenzierungshemmenden Wirkung von embryotoxischen Substanzen zu untersuchen. In einem in vitro Differenzierungsmodell sollen embryotoxische Substanzen an humanen Milchdrüsenepithelzellen auf ihre differenzierungshemmende Wirkung getestet und ein Embryotoxizitätstest entwickelt werden.

Hintergrund des Projektes

Noch bis zum Ende der 50er Jahre gab es keine speziellen Richtlinien über die Prüfung von Arzneimitteln vor der Zulassung auf embryotoxische Effekte. Erst Ende der 50er Jahre wurde durch die „Contergan“-Katastrophe (Wirkstoff Thalidomid) die fruchtschädigende Wirkungen von Arzneimitteln als besonders schwerwiegende Nebenwirkungen erkannt. Um ein Risiko für den Menschen möglichst auszuschließen, müssen Substanzen der chemischen und pharmazeutischen Industrie daher nicht nur auf deren toxikologisches Profil untersucht werden, sondern auch auf ihre reproduktionsschädigende Wirkungen. Besonders die Embryotoxizität, die auf dem teratogenen (fruchtschädigenden) Potenzial einer Substanz beruht und abnorme Embryogenese und Missbildungen auslöst, gehört zu den gefährlichsten Nebenwirkungen einer Substanz. Deshalb gehören zu den nach internationalen Richtlinien vorgeschriebenen Versuchen seit Ende der 50er Jahre auch in vivo Studien, die es erlauben, Substanzen auf deren teratogenes Potential zu untersuchen. Die embryonale Entwicklung und die maternal-fetal-plazentaren Interaktionen sind sehr komplex und es ist wenig bekannt über die sehr unterschiedlichen Wirkmechanismen der Teratogene. Daher ist allgemein akzeptiert, dass die Tierversuche an trächtigen Ratten oder Kaninchen in der Reproduktionstoxikologie nicht durch in vitro Methoden ersetzt werden können, zumindest nicht in der näheren Zukunft. Dennoch besteht Einigkeit darüber, dass die Anzahl der benötigten Versuchstiere deutlich reduziert werden kann, wenn als Screening-Verfahren Alternativmethoden verwendet werden, die in der Lage sind, Substanzen nach ihrem embryotoxischen Potential zu klassifizieren, so dass Tierversuche auf ein Mindestmaß beschränkt werden können. Verschiedene Alternativmethoden sind in den vergangenen Jahren entwickelt worden, die zur Abschätzung embryotoxischer Effekte von Substanzen dienen sollen. Bisher wurde jedoch noch kein in vitro Testsystem akzeptiert und zugelassen.

Ziel unseres Forschungsprojektes ist es, die Vorzüge, die der embryonale Stammzelltest (EST) (Spielmann et al. 1997 (1) ) aufweist beizubehalten, aber die bisher verwendeten embryonalen Stammzellen der Maus durch ein einfacheres humanes Modellsystem zu ersetzen, welches nur eine spezifische Differenzierungsrichtung erlaubt, so dass mittels biochemischer und molekularbiologischer Marker die Differenzierung der Zellen quantitativ erfasst werden kann. Diese Kriterien erfüllen unserer Meinung nach humane Milchdrüsenepithelzellen, die unter Hormoneinfluss spezifisch zu sekretorischen Milchdrüsenepithelzellen differenzieren. Morphologisch wird die Differenzierung durch die Ausbildung einer sogenannten „Dom“-Struktur sichtbar. Als Differenzierungsmarker wurden von uns bisher die Pyraninfärbung und die Expression von ß-Kasein etabliert. Mit Hilfe eines Luziferase-Reporterkonstruktes für ß-Casein soll ein neuer, sehr früh einsetzbarer, Differenzierungstest für das Hochdurchsatz-Screening von embryotoxischen Substanzen etabliert werden. Als Parameter für die fruchtschädigende Wirkung wird wie im EST-Test der Einfluss von Testsubstanzen auf die Differenzierung von Milchdrüsenepithelzellen untersucht. Die akute Toxizität wird mit Hilfe des MTT-Tests ermittelt. Die IC50-Konzentrationen für die Zytotoxizität und die ID50-Konzentrationen für die Hemmung der Differenzierung werden anhand von Konzentrations-Wirkungs-Kurven bestimmt. Mit Hilfe der ermittelten IC50- und ID50-Konzentrationen sollen die Testsubstanzen in drei Embryotoxizitätsklassen eingeteilt werden. Diese sind „nicht“, „schwach“, oder „stark“ embryotoxisch. Die Vorteile, die dieses System bietet, sind: der humane Ursprung der Zellen, eine kurze Differenzierungszeit im Vergleich zum EST-Test, eine homogene Ausgangspopulation, das Vorhandensein von molekularen Differenzierungsmarkern, die eine qualitative und quantitative Auswertung erlauben, die Möglichkeit der Kultivierung der Zellen in Mikrotiterplatten, so dass eine Automatisierung der Zellkultur mit Hochdurchsatz-Screening möglich wird. Dies ist ein wichtiger Aspekt in Bezug auf REACH, da dort ca. 30.000 Chemikalien auch auf Reproduktionstoxizität getestet werden müssen.

Stand der experimentellen Arbeiten

In Vorarbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass die sekretorische (laktogene) Differenzierung von Milchdrüsenepithelzellen der Maus in vitro möglich ist. Dieses Modellsystem hat sich als äußerst robust und überaus reproduzierbar erwiesen und soll nun auf humane Milchdrüseneptithelzellen übertragen werden.

Beginn des Projektes

Beteiligte Labore

Zentrum für Biomedizinische Nanotechnologie (ZBN); zet-LSL

Finanzierung

BMWF (in Beantragungsphase)

Quellen

(1) Spielmann H, Pohl I, Döring B, Liebsch M, Moldenhauer F. The embryonic stem cell test (EST), an in vitro embryotoxicity test using two permanent mouse cell lines: 3T3 fibroblasts and embryonic stem cells. In vitro Toxicol 1997;10:119-27.